IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) adalah analog substrat β-galactosidase, yang sangat mudah diinduksi. Di bawah induksi IPTG, penginduksi dapat membentuk kompleks dengan protein represor, sehingga konformasi protein represor berubah, sehingga tidak dapat berikatan dengan gen target, dan gen target diekspresikan secara efisien. Jadi bagaimana seharusnya konsentrasi IPTG ditentukan selama percobaan? Apakah semakin tinggi konsentrasinya semakin baik?
Pertama, mari kita pahami prinsip induksi IPTG: Operon laktosa (elemen) E. coli mengandung tiga gen struktural, Z, Y, dan A, yang masing-masing mengkode β-galaktosidase, permease, dan asetiltransferase. lacZ menghidrolisis laktosa menjadi glukosa dan galaktosa, atau menjadi allo-laktosa; lacY memungkinkan laktosa di lingkungan untuk melewati membran sel dan masuk ke dalam sel; lacA mentransfer gugus asetil dari asetil-CoA ke β-galaktosida, yang berperan dalam menghilangkan efek toksik. Selain itu, terdapat sekuens operator O, sekuens awal P, dan gen pengatur I. Gen I mengkode protein represor yang dapat mengikat posisi O dari sekuens operator, sehingga operon (meta) ditekan dan dimatikan. Terdapat juga situs pengikatan untuk protein aktivator gen katabolik—situs pengikatan CAP—di hulu sekuens inisiasi P. Sekuens P, sekuens O, dan situs pengikatan CAP bersama-sama membentuk wilayah pengaturan operon lac. Gen pengkode dari ketiga enzim tersebut diatur oleh wilayah pengaturan yang sama untuk mencapai ekspresi produk gen yang terkoordinasi.
Tanpa adanya laktosa, operon lac (meta) berada dalam keadaan represi. Pada saat ini, represor lac yang diekspresikan oleh sekuens I di bawah kendali sekuens promotor PI mengikat sekuens O, yang mencegah RNA polimerase mengikat sekuens P dan menghambat inisiasi transkripsi; ketika laktosa hadir, operon lac (meta) dapat diinduksi. Dalam sistem operon (meta) ini, penginduksi sebenarnya bukanlah laktosa itu sendiri. Laktosa masuk ke dalam sel dan dikatalisis oleh β-galaktosidase untuk diubah menjadi alolaktosa. Alolaktosa, sebagai molekul penginduksi, mengikat protein represor dan mengubah konformasi protein, yang menyebabkan disosiasi protein represor dari sekuens O dan transkripsi. Isopropiltiogalaktosida (IPTG) memiliki efek yang sama dengan alolaktosa. Ini adalah penginduksi yang sangat kuat, yang tidak dimetabolisme oleh bakteri dan sangat stabil, sehingga banyak digunakan di laboratorium.
Bagaimana cara menentukan konsentrasi IPTG yang optimal? Ambil contoh E. coli.
Strain E. coli BL21 hasil rekayasa genetika yang mengandung pGEX rekombinan positif (CGRP/msCT) diinokulasi ke dalam media cair LB yang mengandung 50μg·mL-1 Amp, dan dikultur semalaman pada suhu 37°C. Kultur tersebut kemudian diinokulasi ke dalam 10 botol berisi 50mL media cair LB segar yang mengandung 50μg·mL-1 Amp dengan rasio 1:100 untuk kultur ekspansi, dan ketika nilai OD600 mencapai 0,6~0,8, IPTG ditambahkan hingga konsentrasi akhir 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, dan 1,0 mmol·L-1. Setelah induksi pada suhu dan waktu yang sama, 1 mL larutan bakteri diambil, dan sel-sel bakteri dikumpulkan dengan sentrifugasi dan dianalisis menggunakan SDS-PAGE untuk menganalisis pengaruh berbagai konsentrasi IPTG terhadap ekspresi protein, kemudian dipilih konsentrasi IPTG dengan ekspresi protein terbesar.
Setelah melakukan percobaan, akan ditemukan bahwa konsentrasi IPTG tidak boleh setinggi mungkin. Hal ini karena IPTG memiliki toksisitas tertentu terhadap bakteri. Konsentrasi yang melebihi batas juga akan membunuh sel; dan secara umum, kita berharap semakin banyak protein terlarut yang diekspresikan dalam sel, semakin baik, tetapi dalam banyak kasus ketika konsentrasi IPTG terlalu tinggi, sejumlah besar inklusi akan terbentuk di dalam tubuh, tetapi jumlah protein terlarut berkurang. Oleh karena itu, konsentrasi IPTG yang paling sesuai seringkali bukan semakin besar semakin baik, tetapi semakin rendah konsentrasinya.
Tujuan induksi dan kultivasi strain hasil rekayasa genetika adalah untuk meningkatkan hasil protein target dan mengurangi biaya. Ekspresi gen target tidak hanya dipengaruhi oleh faktor-faktor strain itu sendiri dan plasmid ekspresi, tetapi juga oleh kondisi eksternal lainnya, seperti konsentrasi penginduksi, suhu induksi, dan waktu induksi. Oleh karena itu, secara umum, sebelum protein yang tidak dikenal diekspresikan dan dimurnikan, sebaiknya dilakukan studi terhadap waktu induksi, suhu, dan konsentrasi IPTG untuk memilih kondisi yang tepat dan mendapatkan hasil eksperimen terbaik.
Waktu posting: 31 Desember 2021