IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) adalah analog dari substrat β-galaktosidase, yang sangat dapat diinduksi.Dengan induksi IPTG, penginduksi dapat membentuk kompleks dengan protein represor, sehingga konformasi protein represor berubah, sehingga tidak dapat berikatan dengan gen target, dan gen target diekspresikan secara efisien.Lalu bagaimana cara menentukan konsentrasi IPTG selama percobaan?Apakah semakin besar semakin baik?
Pertama, mari kita pahami prinsip induksi IPTG: Operon (elemen) laktosa E. coli mengandung tiga gen struktural, Z,Y, dan A, yang masing-masing mengkode β-galaktosidase, permease, dan asetiltransferase.lacZ menghidrolisis laktosa menjadi glukosa dan galaktosa, atau menjadi alo-laktosa;lacY memungkinkan laktosa di lingkungan melewati membran sel dan memasuki sel;lacA mentransfer gugus asetil dari asetil-KoA ke β-galaktosida, yang melibatkan penghilangan efek toksik.Selain itu terdapat sekuens operasi O, sekuens awal P, dan gen pengatur I. Kode gen I merupakan protein represor yang dapat berikatan dengan posisi O sekuens operator, sehingga operon (meta) tertekan dan matikan.Terdapat juga situs pengikatan untuk situs pengikatan protein-CAP aktivator gen katabolik di bagian hulu dari rangkaian inisiasi P. Urutan P, rangkaian O, dan situs pengikatan CAP bersama-sama membentuk wilayah pengaturan operon lac.Gen pengkode ketiga enzim diatur oleh wilayah regulasi yang sama untuk mencapai ekspresi produk gen yang terkoordinasi.
Dengan tidak adanya laktosa, lac operon (meta) berada dalam keadaan represi.Pada saat ini, represor lac yang diekspresikan oleh sekuens I di bawah kendali sekuens promotor PI berikatan dengan sekuens O, yang mencegah RNA polimerase berikatan dengan sekuens P dan menghambat inisiasi transkripsi;bila terdapat laktosa, operon lac (meta) dapat diinduksi. Dalam sistem operon (meta), penginduksi sebenarnya bukanlah laktosa itu sendiri.Laktosa masuk ke dalam sel dan dikatalisis oleh β-galaktosidase untuk diubah menjadi alolaktosa.Yang terakhir, sebagai molekul penginduksi, berikatan dengan protein represor dan mengubah konformasi protein, yang menyebabkan disosiasi protein represor dari urutan O dan transkripsi.Isopropylthiogalactoside (IPTG) memiliki efek yang sama dengan allolactose.Ini adalah penginduksi yang sangat kuat, tidak dimetabolisme oleh bakteri dan sangat stabil, sehingga banyak digunakan di laboratorium.
Bagaimana cara menentukan konsentrasi IPTG yang optimal?Ambil E.coli sebagai contoh.
Strain E. coli BL21 hasil rekayasa genetika yang mengandung pGEX rekombinan positif (CGRP/msCT) diinokulasi ke dalam media cair LB yang mengandung 50μg·mL-1 Amp, dan dikultur semalaman pada suhu 37°C.Kultur di atas diinokulasi ke dalam 10 botol media cair LB segar berukuran 50mL yang mengandung 50μg·mL-1 Amp dengan perbandingan 1:100 untuk kultur ekspansi, dan ketika nilai OD600 adalah 0,6~0,8, IPTG ditambahkan ke konsentrasi akhir.Ini adalah 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0mmol·L-1.Setelah induksi pada suhu dan waktu yang sama, 1 mL larutan bakteri diambil darinya, dan sel bakteri dikumpulkan dengan cara sentrifugasi dan dilakukan SDS-PAGE untuk menganalisis pengaruh konsentrasi IPTG yang berbeda terhadap ekspresi protein, dan kemudian pilih konsentrasi IPTG dengan ekspresi protein terbesar.
Setelah dilakukan percobaan, diketahui bahwa konsentrasi IPTG tidak sebesar mungkin.Hal ini dikarenakan IPTG mempunyai toksisitas tertentu terhadap bakteri.Melebihi konsentrasi juga akan membunuh sel;dan secara umum, kami berharap semakin banyak protein larut yang diekspresikan di dalam sel, semakin baik, namun dalam banyak kasus ketika konsentrasi IPTG terlalu tinggi, sejumlah besar inklusi akan terbentuk.Tubuh, tetapi jumlah protein terlarut menurun.Oleh karena itu, konsentrasi IPTG yang paling cocok seringkali bukan semakin besar semakin baik, namun semakin rendah konsentrasinya.
Tujuan induksi dan budidaya strain rekayasa genetika adalah untuk meningkatkan hasil protein target dan mengurangi biaya.Ekspresi gen target tidak hanya dipengaruhi oleh faktor strain itu sendiri dan ekspresi plasmid, tetapi juga oleh kondisi eksternal lainnya, seperti konsentrasi penginduksi, suhu induksi, dan waktu induksi.Oleh karena itu, secara umum, sebelum protein yang tidak diketahui diekspresikan dan dimurnikan, yang terbaik adalah mempelajari waktu induksi, suhu dan konsentrasi IPTG untuk memilih kondisi yang sesuai dan memperoleh hasil eksperimen terbaik.
Waktu posting: 31 Des-2021