Dithiothreitol (DTT) adalah zat pereduksi yang umum digunakan, juga dikenal sebagai aditif hijau baru.Ini adalah senyawa organik molekul kecil dengan dua gugus merkaptan (-SH).Karena sifat pereduksi dan stabilitasnya, DTT banyak digunakan dalam eksperimen biokimia dan biologi molekuler.
Peran utama DTT adalah mengurangi ikatan disulfida pada protein dan biomolekul lainnya.Ikatan disulfida merupakan bagian penting dari pelipatan dan stabilitas protein, namun dalam kondisi percobaan tertentu, seperti analisis SDS-PAGE yang dapat direduksi, rekombinasi dan pelipatan protein, ikatan disulfida menjadi dua gugus tiol perlu direduksi untuk mengungkap struktur spasial protein. proteinnya.DTT dapat bereaksi dengan ikatan disulfida untuk mereduksinya menjadi gugus merkaptan, sehingga membuka struktur spasial protein dan memudahkan analisis dan manipulasi.
DTT juga dapat digunakan untuk melindungi aktivitas dan stabilitas enzim.Dalam beberapa reaksi yang dikatalisis oleh enzim, aktivitas enzim dapat dikurangi oleh oksidan.DTT dapat bereaksi dengan oksidan untuk mereduksinya menjadi zat yang tidak berbahaya, sehingga melindungi aktivitas dan stabilitas enzim.
Dibandingkan dengan zat pereduksi tradisional seperti β-mercaptoetanol (β-ME), DTT dianggap sebagai zat pereduksi yang lebih aman dan stabil.Ia tidak hanya stabil dalam larutan air, tetapi juga mempertahankan sifat pereduksinya pada suhu tinggi dan kondisi asam basa.
Penggunaan DTT relatif sederhana.Secara umum, DTT dilarutkan dalam buffer yang sesuai dan kemudian ditambahkan ke sistem eksperimen.Konsentrasi DTT yang optimal perlu ditentukan berdasarkan eksperimen spesifik, dan umumnya digunakan pada kisaran 0,1-1mM.Konsentrasi yang lebih rendah dapat mengurangi efek buruk pada pertumbuhan sel dan dapat mengurangi sitotoksisitas akibat ekspresi berlebih dari protein target.Konsentrasi yang lebih tinggi dapat menyebabkan beban metabolisme sel yang berlebihan, sehingga mempengaruhi pertumbuhan sel dan efisiensi ekspresi.
Cara menentukan konsentrasi optimal dapat dilakukan dengan mengevaluasi tingkat ekspresi protein target dengan melakukan uji induksi IPTG pada konsentrasi yang berbeda.Uji kultur skala kecil dapat dilakukan dengan menggunakan rentang konsentrasi IPTG (misalnya 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM, dll.) dan efek ekspresi pada konsentrasi yang berbeda dapat dievaluasi dengan mendeteksi tingkat ekspresi protein target (misalnya Western deteksi noda atau fluoresensi).Berdasarkan hasil percobaan, konsentrasi dengan efek ekspresi terbaik dipilih sebagai konsentrasi optimal.
Selain itu, Anda juga dapat merujuk pada literatur yang relevan atau pengalaman laboratorium lain untuk memahami rentang konsentrasi IPTG yang umum digunakan dalam kondisi eksperimen serupa, kemudian mengoptimalkan dan menyesuaikan sesuai dengan kebutuhan eksperimen.
Penting untuk dicatat bahwa konsentrasi optimal dapat bervariasi tergantung pada sistem ekspresi yang berbeda, protein target, dan kondisi percobaan, jadi yang terbaik adalah mengoptimalkannya berdasarkan kasus per kasus.
Singkatnya, DTT adalah zat pereduksi yang umum digunakan yang dapat digunakan untuk mengurangi ikatan disulfida dalam protein dan biomolekul lain serta untuk melindungi aktivitas dan stabilitas enzim.Ini telah banyak digunakan dalam percobaan biokimia dan biologi molekuler.
Waktu posting: 28 Sep-2023